黄芪甲苷的新型提取方法研究

1 材料

黄芪是豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch. ) Bge. var. mongholicus ( Bge. ) Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch. ) Bge的干燥根。昧甘，性微温，具补气升阳，益卫固表、托疮生肌等功效，药用历史悠久、广泛。其化学成分有多糖、皂苷、黄酮等。现代药理研究证明，黄芪多糖和黄芪皂苷为其中的主要成分，其中皂苷以黄芪甲苷为主，有着广泛的药理作用。黄芪的有效成分提取主要有醇提法和水提法，黄芪类制剂多以水煮醇沉，取上清液部分或取醇沉部分，对药用资源的浪费比较严重。黄芪多糖提取的方法多为水煮醇沉，得率和含量较低，精制过程繁琐且耗费大量有机溶剂。黄芪皂苷类化合物粗提取有水煮醇沉取上清液和醇提法，精制方法多先以醇类溶剂(如乙醇或甲醇等)提取，然后以正丁醇萃取。其法操作繁琐，且有机溶剂用量大。现将“液-液连续萃取方法及装置”发明专利技术应用到黄芪化学成分黄芪甲苷提取中，提出一种新型提取方法，为解决上述问题提供参考。

日本岛津LC22010A高效液相色谱仪，自动进样系统，CLASS2VPver.6.0色谱数据工作站；SPSS 12.0软件包；黄芪药材由甘肃效灵生物开发有限责 任公司提供，并经兰州大学药学院生药研究所马志刚教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch. ) Bge. var. mongholicus ( Bge. ) Hsiao；黄芪甲苷(中国药品生物制品检定所，批号 0815-200406)。

2 黄芪甲苷含量测定

2．1 色谱条件 ODS-1色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)乙腈一水(2：1)洗脱，进样量10 μL，流速 1.0 mL.min^-1，检测波长200 nm，柱温25℃ 。

2．2 对照溶液制备 精密称取干燥至恒重的黄芪甲苷对照品25 mg，置25 mI 量瓶中，加无水乙醇溶解至刻度，制成对照品溶液。

2．3 标准曲线的制作 分别精密吸取对照品溶液 0.10，0.20，0.30，0.40 mL，分别加入无水乙醇补足至0.60 mL，各加入8%香草醛无水乙醇试剂 0.50 mL，摇匀。缓缓加入72%硫酸0.5mL，摇匀，62℃水浴保温20 min。取出后迅速冷却至室温，于 538 nm波长处测定。得回归方程：A=-0.019 5 +0.020 2C，r=0.998 6(n=4)，线性范围16.67~66.67 mg.L^-1 。

2．5 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液，按标准曲线项下方法操作，连续重复测定5次，RSD 为1.28%。

2．4 样品的测定 精密称取黄芪提取物样品160mg，加少量水溶解，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次10 mL。合并萃取液，用正丁醇饱和的水10 mL洗1次，减压浓缩至干。以50%甲醇-水20 mL溶解浓缩物，溶液以0.5 mL.min^-1的速度经由中性氧化铝柱(4 g，100~200目)，并继续用50%甲醇-水溶液40 mL冲柱。合并通过液及洗液，减压浓缩至于，以无水乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中，精密吸取样品滤液0.25 mL，加无水乙醇补足至0.6 mL，按标准曲线制备项下操作，测定样品。

2．6 重复性试验 取黄芪提取物粉末，共5份，每份约160 mg，精密称定，按样品溶液的制备项下处理并测定，该批样品黄芪甲苷含量为6.30%，RSD为2.90%。

2．7 加样回收率试验 取上述已知含量的黄芪提取物粉末，共6份，每份80 mg，精密称定，每份各精密加入对照品溶液(含黄芪甲苷0.500 4 mg)，按供试品溶液的制备项下处理并测定，得平均回收率为103.87%，RSD为1.81%。

2．8 稳定性试验 取黄芪提取物粉末1份约160 mg，精密称定，按样品溶液的制备项下处理，分别在0，8，16，24 h，1，2，3 d分别进样，记录峰面积，结果RSD为2.88%。

3．1 药材对溶剂的吸附量 将黄芪药材粉碎过20目筛，取30 g，置于250 mL的盛有适量95%乙醇的烧杯中混匀，每0.5 h过滤得药渣称重。结果80min后质量不再增加，吸附量达42.1 g，约是药材量的1.4倍。所以3倍量的溶剂就可以保证药材与溶剂充分接触，使提取的化学成分容易在药材和溶剂之间达到平衡。

3 提取新方法研究

黄芪加95%乙醇在液-液连续萃取装置中提 取，提取液浓缩、真空干燥即得。

3．2 黄芪甲苷在药材和溶剂中浓度达到平衡时的时间确定 取100 mL烧瓶3个，分别准确称取10 g左右的黄芪，加入95%乙醇25 mL，在30℃搅拌回馏，30 min后每10 min用移液管取1 mL溶液， 并补加95%乙醇1 mL。取出的溶液放冷至室温过滤，蒸除乙醇，根据“2．4”项操作作为样品溶液测定黄芪甲苷的含量，取3个平行试验的平均值。分别在40，50，60，70℃下同法操作。结果如图1。由图可知，50℃ 效率较高，平衡时间大约在40~60 min之间，平衡时溶剂中质量浓度大约在0.1 g.L_-1 左右。

图1 提取液中黄芪甲苷含量

3．3 提取新方法的醇提工艺正交实验设计 在醇提工艺中主要影响因素就是溶剂循环次数和温度，前者可以取决于浓缩子系统的蒸馏速度(溶剂循环周期数)和时间。根据“3．2”结果可以较为合理安排正交试验的因素和水平，见表1。

表1 提取工艺因素水平

取100 mL烧瓶9个，分别准确称取10 g左右的黄芪，加人25 mL 95%乙醇，放入磁子，安装到液-液连续萃取装置上。分别根据正交试验设计进行提取，提取完毕，蒸除溶剂。60℃ 真空干燥至恒重。根据“2．4”项下样品溶液操作，测定黄芪甲苷含量(每1 g原药材所含的总黄酮量)。结果见表2。

表2 醇提工艺正交试验及结果

3．4 方差分析结果 表2直观分析，黄芪甲苷含量的极差数据RB>RD>RA ，各因素作用主次为B>D >A，A2B2D2较佳。综合方差分析结果可看出(表3)，因素B、D的P<0.05．对黄芪甲苷含量的影响有统计学意义；而因素A的P>0.05，对含量的影响无统计学意义。由此为减少能源消耗，降低生产成本，最佳提取条件的搭配应为A1B2D2即溶剂循环3个周期。提取温度40℃，蒸馏时间3 h。

醇提最佳工艺的验证：按A1B2D2 最佳条件提取，测定黄芪甲苷含量为2.523 5 mg.g_-1 (n=5， RSD =7.4%)

表3 黄芪甲苷含量方差分析

4 讨论

“液-液连续萃取方法及装置”发明专利是一种新颖的提取方法，是对现有提取理论和方法新颖组合、改进。与传统方法较为，提取理论并未改变，不同点在于对现有理论、科技应用的重组改造。所以生产工艺控制关键科技参数与传统工艺有较大差异：(1)确定药材对溶剂的吸附量：提取子系统通过溶剂循环周期控制浓度梯度，无需加大溶剂体积，只要维持溶剂与药材的充分接触就能够。所以确定药材的溶剂吸附量，一层面用来估算生产能力，另一方面确定工艺研究中估算溶剂循环周期数范围。 (2)提取物在药材和溶剂中浓度达到平衡的时间：对于某种药材，采用特定溶剂，在一定的搅拌速度、提取温度下，被提取物在药材和溶剂中浓度梯度变化 速度也一定。因此必须考查提取物在药材和溶剂中浓度达到平衡最短时间。基于这些数据来试验工艺控制关键技术参数中的提取时间。(3)确定提取温度；对于某种药材，使用特定的溶剂，在一定的搅拌速度下，被提取物在药材和溶剂中浓度梯度变化速 度受温度影响，从而直接影响提取效率与速度。因此，经由考查提取温度、药材的溶剂吸附量和提取物在药材和溶剂中浓度达到平衡的时间，选择改进工艺的影响因素水平。

根据文献报道，传统方法提取黄芪甲苷，含量在0.047~1.862 mg.g_-1 (以原药材计算)，利用本文方法提取黄芪甲苷，含量为2.523 5mg.g_-1 ，收率上升。本结果表明，新工艺生产周期短、操作简 、便、环境污染较小、产品质量、品质明显高，具有一定的应用前景。